1. Panorama geral

Em 1798, no seu famoso "População: o primeiro ensaio", Thomas Malthus avaliava que a população mundial estava crescendo em escala exponencial enquanto a produção de alimentos crescia em mera escala aritmética. Portanto, previa ele ser a fome no mundo inevitável. Em pouco tempo a ciência mostrou que essa lógica não era correta. As novas tecnologias agronômicas, como adubação, uso de pesticidas e melhoramento genético, levaram a produção de alimentos a patamares muito superiores aos que seriam necessários para alimentar a todos caso existisse no planeta uma distribuição de recursos satisfatória. Entretanto, neste novo milênio a lógica de Malthus merece ser revista. Nos próximos 25 anos prevê-se que o planeta receberá 2,5 bilhões de novos tripulantes e que os países em desenvolvimento necessitarão dobrar a sua produção de alimentos. Neste cenário existem barreiras hidrogeográficas difíceis de serem superadas. Por exemplo, suprimento de água doce e existência de terras agriculturáveis. Além disso, mesmo onde essas condições ainda não são limitantes, tem-se que pelejar contra as perdas provocadas por pragas e doenças. Estima-se que 40% e 20% da produção agrícola em países em desenvolvimento e desenvolvidos, respectivamente, é perdida devido a ação de pragas e patógenos. Desses, um terço pela ação de vírus, fungos e bactérias (Somerville and Briscoe, 2001).

Assim sendo, vemos dois tipos de fatores influenciando o aumento da produção de alimentos na terra: os físicos e os biológicos. Quanto aos físicos há pouco o que pode ser feito para ampliá-los. Neste caso a única saída possível é o melhor gerenciamento dos recursos. Quanto aos biológicos, aí sim, há muito a ser feito.

2. Plantas e patógenos: o paradigma da "Red Queen" e projetos genoma.

Na famosa história infantil de Lewis Caroll, "Alice no país das maravilhas", há uma curiosa passagem em que a personagem corre, corre, corre, mas tudo ao seu redor corre também. Ou seja, é uma corrida para não se sair do lugar. Essa passagem tem sido largamente utilizada em uma perspectiva evolutiva para se comparar o que ocorre entre hospedeiros e patógenos (Hines and Marx, 2001). Ou seja, por mais que os hospedeiros "corram" para buscar novas estratégias para escapar dos seus algozes, os patógenos sempre acabam encontrando formas de superar a resistência conseguida pelos primeiros. É uma corrida sem fim, mas que tem que ser disputada, e o papel da ciência nesta corrida é o de prover uma "dianteira" para os hospedeiros.

Com esse objetivo a ciência necessita de duas coisas. Primeiro, entender os competidores, e aí se encaixa a ciência básica na qual se incluem os projetos genoma. A segunda é a geração de estratégias capazes de interferir com os competidores, ou para prejudicá-los, como com o uso de fungicidas, herbicidas e pesticidas, ou para auxiliá-los, como com a aplicação de adubos ou o melhoramento genético. Neste último caso temos o método convencional e os controversos transgênicos, aos quais os projetos genoma são muitas vezes erroneamente associados.

Em relação aos genomas, nos últimos anos houve uma verdadeira explosão desses projetos. O objetivo é conhecer a informação contida no DNA das células, que é o que determina as suas possibilidades. Ou seja, é lá que estão escritas as instruções para o funcionamento das células.

O DNA é uma longa molécula em forma de fita composta de quatro tipos de unidades denominadas de nucleotídeos. São elas a adenina (A), guanina (G), timina (T) e citosina (C), que representam o alfabeto da vida. As fita do DNA são organizadas nas células aos pares, sendo que uma fita é unida a outra por ligações fracas entre as bases nitrogenadas dos nucleótides, e a seqüência de uma fita determina a seqüência do seu par, que corre em um sentido antiparalelo. Um A sempre irá parear com um T e um C com um G, de forma que se refere normalmente a unidade do DNA como unidade de par de base (base pair-bp). Essa longas fitas assim unidas formam a dupla hélice do DNA cujo tamanho, composição e arquitetura variam enormemente entre as espécies. Por exemplo, as bactérias possuem cerca de 2 a 5 milhões (Mega) de bp (Mb) organizados normalmente em um cromossomo circular, bem diferente dos eucariotos, que organizam o seu DNA em alguns cromossomos lineares. Sobre o conteúdo, as leveduras e fungos, ditos eucariotos inferiores, possuem de 10 a 40 Mb, os vermes por volta de 100 Mb, insetos giram em torno de 300 Mb e o homem possui cerca de 3 bilhões de bp. As variações de conteúdo para os diferentes grupos é enorme e a quantidade de DNA contido em um organismo não necessariamente reflete a sua complexidade. Por exemplo, nas plantas, a ervilha e o milho possuem cerca de 5 bilhões de bp, o trigo 17 bi e a frutilária 120 bi. Ou seja, uma quantidade bem maior do que a presente em humanos.

Dentro de um genoma existem dois tipos básicos de seqüência: as codantes e as não codantes. Nas primeiras estão os genes, que são seqüências de nucleotídeos transcritas em moléculas intermediárias chamadas de RNA mensageiro (mRNA), que por sua vez serão traduzidas pelos ribossomos segundo um código genético (cada trinca de nucleotídeo corresponde a um aminoácido) para formar as proteínas. São essas últimas as responsáveis pela maior parte da estrutura e funcionamento das células, e a sua composição basicamente define as características e propriedades de um determinado organismo. Também nesta classe estão incluídos os genes que codificam tipos específicos de RNA, como o ribossômico e o transportador. O outro tipo de seqüência é a não codante, na qual se incluem promotores (regiões de DNA localizados fora da região codante dos genes, mas que definem o padrão de transcrição desses), regiões de importância estrutural (origens de replicação, centrômeros e telômeros) e o assim chamado, precipitadamente, de "DNA lixo". Esse último subtipo corresponde à seqüência para a qual ainda não se encontrou função definida mas que é altamente provável que tenha alguma. Corresponde aos introns, seqüências que interrompem a parte codante dos genes - os exons - e que são removidas do mRNA através de um processamento específico, e as seqüências repetitivas, muitas delas resultantes de pareamento incorreto durante a replicação ou à ação da incorporação de vírus ou movimentação de transposons.

Curiosamente, quanto maior o conteúdo de DNA de um determinado organismo, maior o conteúdo de DNA não codante, e portanto menor a densidade de genes. Por exemplo, na bactéria Escherichia coli com 4,64 Mb foram encontrados 4.397 genes (Blattner et al., 1997), uma média de um gene a cada 1.050 bp. Nas leveduras, em 12 Mb foram localizados cerca de 6.600 genes (Goffeau et al., 1996) (um gene a cada 1.800 bp) e nos humanos, com 3.000 Mb foram até agora identificados cerca de 40.000 genes (Venter et al., 2001; Lander et al., 2001). Ou seja, apenas um gene a cada 75.000 bp. O conhecimento desses dados é essencial quando se busca realizar o seqüenciamento do genoma de um determinado organismo e a partir dele pode-se delinear a estratégia a se utilizar como veremos abaixo.

3. Aspectos técnicos da condução de projetos genoma

As razões que possibilitaram o avanço dos projetos genoma foram de natureza técnica, especificamente o aumento na velocidade do seqüenciamento e o desenvolvimento da bioinformática. Para se ter uma idéia, a iniciativa pública do projeto genoma humano, iniciado em 1990 e com prazo previsto para ser completado em 2005, tinha seqüenciado até 1998 cerca de apenas 3% do genoma. Nos 2 anos seguintes, com a introdução de novos equipamentos com a tecnologia capilar, completou-se o trabalho restante em termos de geração de seqüências. O consórcio público seqüenciou 22 bilhões de bp (Lander et al., 2001)e a CELERA, empresa privada pertencente majoritariamente à Applied Biosystem, uma companhia que fabrica seqüenciadores, cerca de 14.5 bilhões de bp (Venter et al., 2001). Não é exagero afirma que as novas tecnologias permitem hoje que um sequenciador faça no intervalo de poucas horas o que grupos de seqüenciadores faziam no início da década de 90 no período de um ano.

Existem duas formas básicas de se realizar um projeto genoma: via DNA ou via mRNA. No primeiro caso uma técnica inicialmente controvertida mas que se consagrou nos últimos anos foi a do shotgun (Venter et al., 1998). Por ela todo o DNA do organismo é aleatoriamente fragmentado em pequenos pedaços, de 1000 a 2000 bp, que são seqüenciados e posteriormente montados (assembling) via Bioinformática, como se fossem peças de um quebra-cabeça. As seqüências com sobreposição são ordenadas pelas suas partes comuns de forma a recomporem a seqüência original. Um problema dessa metodologia é a ordenação de fragmentos em regiões repetitivas. Ou seja, como em cada reação de seqüenciamento obtêm-se a identidade de apenas cerca de 500 bp (denominado "read"), se no genoma existem zonas de DNA repetitivo com extensão maior do que essa torna-se difícil interpretar a localização das seqüências individuais. Para contornar esse problema é comum, em genomas complexos, a realização de clonagem de fragmentos maiores em vetores do tipos cosmídeos ou cromossomos artificiais de bactérias (BAC) ou leveduras (YAC), que são seqüenciados individualmente e levados para a montagem já como grandes pedaços.

Uma questão que se levanta é qual o número de seqüências necessário para se realizar um genoma completo? Não há uma resposta simples para essa pergunta, visto que isso depende da complexidade de cada tipo de genoma, no qual tem-se que considerar o conteúdo de zonas repetitivas, regiões de difícil clonagem, de baixa complexidade, entre outros. Entretanto, convencionou-se considerar que o seqüenciamento de uma quantidade de nucleotídeos que permita cerca de 5X a "cobertura" do genoma é um número com o qual normalmente se atinge acima de 95% de fechamento. Por cobertura entenda-se o número mínimo teórico de "reads" que seria capaz de fechar um determinado genoma se não houvesse sobreposição entre eles. Por exemplo, um genoma de 2 Mb necessita teoricamente de um mínimo de 4000 reads para cobri-lo (4000 reads x 500 bp = 2.000.000bp)

Embora seja o "shotgun" uma estratégia simples, a etapa de montagem de grandes genomas usando essa técnica exige um enorme esforço computacional. Para se avaliar isso, a montagem do genoma humano pela Celera, feita a partir de 26,4 milhões de fragmentos de DNA com tamanho médio de 550 bp exigiu mais de 20.000 horas de processador do mais poderoso computador civil do mundo, que realizou 20 milhões de trilhões de comparações de DNA para realizar essa tarefa, o maior cálculo de biologia computacional da história (Venter et al., 2001). Por outro lado, a montagem de pequenos genomas pode atualmente ser realizada por computadores relativamente modestos, de preço aproximado de U$ 10.000,00, utilizando processadores tipo INTEL, o sistema Linux e programas acadêmicos consagrados como o Phred/Phrap/Consed (Ewing and Green, 1998; Ewing et al., 1998).

A outra forma básica de se fazer genoma é via o mRNAm, usado com freqüência para eucariotos com genomas grandes. A base dessa estratégia é o fato de que quando um gene é expresso é transcrito a partir de sua seqüência uma molécula de mRNA complementar a ela. Nesta molécula não estão contidos os introns, que foram processados, representando portanto apenas o conjunto de códons que darão origem à proteína. Esse mRNA pode ser transformado em DNA a partir da ação de uma enzima, denominada transcritase reversa. O DNA resultante, denominado DNA complementar (cDNA), pode agora ser seqüenciado. Um problema dessa metodologia é a dificuldade de se encontrar a condição correta para se conseguir todos os mRNAs produzidos pelo organismo. Isso porque diferentes tecidos expressam diferentes genes sob diferentes condições e mesmo esses são expressos com diferentes intensidades. Assim sendo, projetos desse tipo raramente conseguem identificar todos os genes de um organismo e na maioria das vezes genes fortemente expressos são seqüenciados muitas vezes e os de expressão fraca ou transiente freqüentemente não são identificados. Além disso, a maior parte das estratégias para seqüenciar cDNA consegue identificar apenas as extremidades da parte codante dos genes, ficando grande parte deles incompleta e sem nenhuma informação sobre a sua região promotora. Uma técnica desenvolvida recentemente no Brasil, denominada ORESTES (Dias et al., 2000; de Souza et al., 2000), tem obtido sucesso na identificação de regiões centrais de cDNAs, mas é uma metodologia que exige grande nível de organização do trabalho de geração de bibliotecas para serem seqüenciadas, sendo de aplicação laboriosa. Também no caso do seqüenciamento via cDNA, uma das missões da Bioinformática é a montagem dos reads, aqui denominada de clusterização, visando gerar a seqüência completa dos genes identificados. Genes identificados apenas parcialmente são denominados de ESTs (Expressed Gene Tag), termo que significa ser a seqüência a "etiqueta" de um gene (Adams et al., 1993).

Uma vez feito o seqüenciamento, outra etapa essencial para um projeto genoma é a anotação dessas seqüências. Por anotação entende-se provir a seqüência de informações biológicas como a localização de genes e tipo de proteína que aquele possível gene codifica. Para essa última missão a maior parte das vezes a anotação inicial é feita via a comparação das seqüências obtidas com os bancos de dados públicos, onde já existem seqüências anotadas, muitas delas fruto de extenso trabalho de bioquímicos que antecederam a biologia molecular. Existem atualmente muitos desses bancos de seqüências "on line", por exemplo o GenBank, que podem ser consultados via programas de comparação específicos do tipo "Blast" (Altschul et al., 1997). O número de seqüências depositadas anualmente nesses bancos é enorme, estimando-se que eles dobram de tamanho a cada 14 meses. Para a maior parte dos projetos genoma a anotação inicial de seqüências é feita automaticamente usando esses programas de comparação, sem que experimentos de bancada (wet lab) sejam realizados. São os chamados experimentos "in silica".

Uma questão sensível é definir o momento de se anotar um genoma. No caso de genomas de shot-gun, principalmente pequenos genomas, é comum se aguardar a finalização do seqüenciamento e montagem para só então realizar-se a anotação. Em caso de cDNA, ao contrário, toda seqüência é normalmente imediatamente comparada e anotada. A vantagem do primeiro procedimento é a segurança da anotação. No segundo caso a vantagem é a possibilidade de rápida identificação de genes relevantes que possam auxiliar no trabalho de bancada.

Se considerássemos uma célula como um computador, poderíamos colocar que a realização de um projeto genoma eqüivale a vasculhar a máquina em busca dos programas que essa tem instalado no seu hardware. Entretanto, essa identificação não nos traz informações sobre os programas que efetivamente estão rodando em um determinando momento ou sob uma determinada condição. Voltando à questão do genoma, saber os genes que um determinado organismo possui não é suficiente para entender como esses genes funcionam. Para responder essa questão nos últimos anos um novo tipo de tecnologia tem sido desenvolvida. Chama-se de Microarranjo de DNA (Schena et al., 1995), comumente denominada de Chip de DNA, que opera através do princípio de hibridação de moléculas com seqüências complementares. Por essa técnica, um robô imprime ordenadamente em uma lâmina milhares de fragmentos de DNA correspondente à seqüência de genes. A célula a ser estudada é submetida a diferentes condições, vamos supor crescimento em 30oC ou 37oC, e seu mRNA é extraído, sendo que essas moléculas refletem os genes que estão "ligados" na célula naquele determinado momento. Esses conjuntos de mRNAs são transcritos reversamente na presença de nucleotídeos marcados com diferentes substâncias fluorescentes. Vamos supor que os cDNAs gerados de mRNAs das células crescidas a 30oC foram marcados com fluorescência verde e os de células crescidas a 37oC marcados com fluorescência vermelha. Feito isso esses dois tipos de cDNAs marcados são misturados e hibridados contra o DNA impresso na lâmina contendo os DNA. As seqüências dos genes para as quais existirem cDNA marcado vão ligar esse cDNA e conseqüentemente vão se tornar pontos fluorescentes na lâmina. A cor de cada ponto vai indicar a situação fisiológica na qual aquele gene foi expresso e a intensidade do seu brilho vai ser proporcional à sua intensidade de expressão. Existem excepcionais exemplos da utilização dessa metodologia para a investigação do metabolismo de microorganismos como Saccharomyces cerevisiae (Eisen et al., 1998; Sniegowski, 1999)

Nos atuais projetos genoma cada vez mais se requer que eles além da identidade dos genes forneçam informações sobre o seu padrão de expressão. Com isso a bioinformática tem novos desafios, na integração de todos esses dados e na sua disponibilização através de ferramentas amigáveis que permitam aos especialistas das mais diferentes áreas, mesmo àqueles pouco afeitos a computadores e à biologia molecular, a mineração eficiente das informações do organismo.

4. Projeto genoma de fungos

Há notícia da conclusão de dezenas de genomas de bactérias (www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html) e até mesmo de organismos com grandes conteúdos de DNA, como a Drosophila melanogaster (www.flybase.bio.indiana.edu) e o verme Caenorhabditis elegans (www.moulon.inra.fr/acedb/acedb.html), isso sem se falar no ser humano (Venter et al., 2001; Lander et al., 2001). Entretanto, no campo dos fungos, apesar da sua enorme importância econômica principalmente como fitopatógenos, pouco foi feito. Estima-se a existência de pelo menos 10.000 doenças de plantas causadas por fungos (Pennisi, 2001). De dados tornados públicos foi realizado o genoma completo apenas da levedura Saccharomyces cerevisiae (Goffeau et al., 1996), e o fungo Neurospora crassa está aparentemente em uma etapa final. Ambos são organismos experimentais. Dos fitopatógenos têm sido anunciado que duas empresas particulares, a Exelixis nos EUA e a Lion na Alemanha, essa mediante contrato com a Bayer, teriam completado o genoma do importante fungo causador da fuligem no milho, o Ustilago maydis. Da mesma forma, a Syngenta, uma empresa nascida da Novartis, estaria completando o genoma dos fungos Cochliobolus heterostrophus, um patógeno de milho, e do Botrytis cinerea, que ataca diferentes plantas. Ou seja, as empresas privadas estão se adiantando ao setor público, buscando as informações genéticas dos organismos visando soluções comerciais patenteáveis para os problemas (Pennisi, 2001). Logicamente esses dados assim gerados são mantidos em sigilo, não sendo acessíveis para pesquisadores de fora das empresas.

A principal razão para essa situação parece estar no tamanho e na complexidade de projetos genoma de fungos, o que reflete no custo e esforço para a sua realização. A maior parte dos fungos tem um conteúdo de DNA aproximadamente 10 vezes superior ao de bactérias e o seu DNA é organizado em cromossomos com muitas estruturas complexas. Assim sendo, são organismos difíceis de terem o seu genoma completado, pois exigem grande quantidade de seqüenciamento e os recursos de bionformática necessários para a sua montagem e análise já são consideravelmente mais complexos que os necessários para bactérias. Em relação aos custos, estima-se que completar um genoma de fungo exija hoje algo em torno de U$ 6 a 10 milhões.

Em relação ao Crinipellis perniciosa, a importância desse fungo se dá pelo fato de ser ele o causador da vassoura de bruxa, hoje sem dúvida o maior problema da cacauicultura brasileira, em especial na Bahia, a principal região produtora. Para se ter uma dimensão dos danos provocados por esse fungo, que foi detectado na Bahia pela primeira vez apenas em 1989, nos últimos anos o Brasil passou de país exportador para país importador de cacau, estimando-se que haja necessidade da compra de cerca de 70.000 t esse ano para suprir a indústria de processamento instalada no país (Dias, 2001). Creio ser desnecessário detalhar neste capítulo as demais conseqüências da doença sobre a cultura do cacau. Apenas vale a pena citar que em torno dela vivem cerca de 3 milhões de pessoas (300.000 empregos diretos) espalhadas em aproximadamente 100 municípios baianos em uma área superior a 700.000 há (Dias, 2001).

5. Crinipellis perniciosa, a vassoura de bruxa e os clones de cacaueiros

Inicialmente vamos apresentar resumidamente a biologia do fungo (Purdy and Schmidt, 1996; Dias, 2001) Não é a intenção aqui a apresentação de dados detalhados, mas apenas das informações relevantes para situar o leitor na questão. Para um aprofundamento do tema, principalmente dos seus aspectos locais, sugerimos uma consulta aos trabalhos desenvolvidos pelos pesquisadores da Ceplac e da UESC nos últimos 10 anos.

O C. perniciosa (Stahel) Singer é uma das 63 espécies conhecidas do gênero Crinipellis, da família Tricholomataceae, que corresponde a maior família em número de espécies da ordem Agaricales do filo Basidiomycota. A sua espécie é ainda subdividida em biótipos de acordo com o hospedeiro que ataca. O biótipo-C ataca especificamente o cacaueiro e apresenta um ciclo de vida hemibiotrófico, ou seja, se hospeda durante uma fase em tecido vivo e durante outra em tecido morto. Em condições naturais, a disseminação da doença resulta da dispersão abiótica de basidiósporos uninucleados liberados dos basidiomas presentes formados na superfície externa dos órgãos do hospedeiro. Ao atingir a superfície dos órgãos de plantas sadias, os esporos germinam, produzindo tubos de germinação monocarióticos que penetram no hospedeiro e atingem os tecidos meristemáticos. O micélio primário, que é infectivo e biotrófico, é caracterizado por hifas largas, não-fibuladas que se localizam entre as células dos tecidos infectados. O fungo induz a um crescimento excessivo e desorganizado nas regiões apicais, geralmente resultando em múltiplos ramos nitidamente mais engrossados do que o único ramo original, formando uma estrutura anômala que é denominada de vassoura verde. A razão desse fenômeno é um ponto de extrema importância a ser investigado. É possível que o fungo possua algum gene ou metabolismo capaz de gerar hormônios vegetais que seriam responsáveis pelo fenótipo, ou o fungo poderia liberar alguma substância capaz de elicitar um desequilíbrio hormonal na planta gerando a vassoura verde. Um fato curioso é a extrema dificuldade de se encontrar o fungo na planta sob essas condições. Amostras de ramos apresentando o fenótipo foram submetidas à microscopia eletrônica de transmissão e após análise de algumas dezenas de seções nenhuma hifa foi encontrada . Isso apontaria para a possibilidade da vassoura verde ser uma resposta da planta à infecção ou a efetores lançados pelo fungo ao penetrar na planta.

Partindo-se dessa fase, após um período que pode variar de 3 a 9 semanas, aparentemente ocorre a dicariotização do micélio fúngico e a formação de um micélio secundário, dicariótico e fibulado, com hifas mais estreitas que invadem as células dos tecidos do hospedeiro onde se encontram, culminando com a morte dos ramos (ex vassoura verde). As vassouras, agora necróticas, de coloração amarronzada, podem permanecer presas à planta ou podem se destacar e cair no solo. O micélio presente nessas vassouras produzem então basidiomas onde são, por sua vez, gerados os basidiósporos, fechando o ciclo de vida do fungo. Mais uma vez é importante observar que a densidade de fungo na planta é aparentemente muito baixa também nesta fase, apontando na direção do fenótipo ser em grande parte uma resposta da planta à infecção, podendo ser a necrose resultante de processos apoptóticos visando restringir a doença à região infectada.

Uma alternativa que tem-se mostrado promissora para combater a vassoura de bruxa é a utilização de clones de plantas que apresentam tolerância ao C. perniciosa. A avaliação dessa tolerância é feita em grande parte pelos próprios agricultores, que notam em suas plantações espécimes menos atacadas. Essas espécimes são avaliadas pela CEPLAC e entregues a Biofábrica, um empreendimento notável vindo de um esforço conjunto da CEPLAC, Governos estadual e federal e a sociedade civil, para a multiplicação e distribuição entre os produtores. A grande preocupação no momento é a possível perda de resistência das cultivares de cacaueiros clonados. Uma questão importante a se ressaltar é que nas regiões de origem do fungo a doença não chega a matar a planta, tendo se tornado endêmica. Ou seja, a biologia dos dois organismos está em uma certa sintonia o que torna mais difícil a evolução de mecanismos de resistência efetivos por parte da planta visto que a sua reprodução não é ameaçada pela doença. Esse é um dos fatos que ajuda a explicar a dificuldade de se encontrar cultivares resistentes de cacau. O que até hoje tem-se verificado é a existência de uma maior tolerância por parte de algumas plantas, mas mesmo essa com forte dependência local. Além disso, mesmo nos lugares que apresentam resistência, tem sido comum a observação de que essa resistência é vencida pelo fungo após algum tempo. Algumas explicações atraentes pare esse fenômeno seriam: (1) existência nas plantas de cacau de populações de microorganismos endofíticos variáveis e localmente dependentes que poderiam combater o C. perniciosa; (2) efeito de nutrientes no solo; (3) alta taxa de recombinação e portanto variabilidade no fungo que faria com que ele sempre consiga rapidamente, visto ter ciclo de vida curto, reorganizar os seus genes acabando por obter combinações capazes de vencer a "tolerância" da planta. Como dito ao início desse capítulo, aqui vale o paradigma da "Red Queen". Correr para não sair do lugar, ou seja, combinações genéticas do cacaueiro que levem à tolerância ao fungo dão à planta uma dianteira muito pequena nesta corrida visto que o fungo consegue muito mais rapidamente novas combinações genéticas para superar a tolerância.

6. Projeto genoma de Crinipellis perniciosa: aspectos técnicos e o seu desenvolvimento

Em vista da complexidade do problema da vassoura de bruxa é que se propôs a realização do projeto Genoma de Crinipellis perniciosa (veja a página do projeto: www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura). Inicialmente, tínhamos que definir a estratégia a ser adotada. Se faríamos um projeto de DNA ou se seqüenciaríamos cDNA. Para essa decisão obtivemos DNA do fungo junto ao Dr. Júlio Cascardo (UESC), construímos uma biblioteca de Shot-Gun a partir desse material, fizemos um projeto piloto seqüenciando 500 fragmentos selecionados ao acaso e comparamos essas seqüências assim obtidas com os genes depositados no GenBank. O resultado nos indicou a alta densidade de genes presentes no fungo, o que é de se esperar para microorganismos eucariotos. Para cerca de 50% das seqüências foram encontrados dentro delas trechos de DNA codante guardando significativa homologia com seqüência de genes anteriormente descritos. Em vista desse resultado optamos por utilizar uma estratégia híbrida para um grande projeto. Seqüenciar fragmentos de DNA genômico gerados a partir de bibliotecas de shotgun, comparando entretanto cada read, à medida que eles vão sendo gerados, com os bancos de dados. Esse é um procedimento semelhante ao realizado por projetos genoma que seqüenciam cDNA, com a vantagem que as seqüências são naturalmente normalizadas, ou seja sua ocorrência não depende da expressão dos genes, pois trata-se de DNA genômico A montagem do genoma completo, embora desejável a médio prazo, não é imprescindível para a identificação e análise de genes, o que pode ser feito durante o seqüenciamento, economizando vultosa quantidade de tempo e recurso. Ou seja, optamos por uma abordagem pragmática de obter o máximo de informação com a menor quantidade de esforço e tempo possível.

Feito o projeto piloto e tendo sido definida a estratégia de seqüenciamento o projeto foi reconhecido pelo Governo da Bahia que, através da Secretaria da Agricultura, se posicionou favoravelmente ao seu financiamento (ver item 8). Com isso foi oficialmente formada a Rede de Genômica da Bahia composta por quatro grupos: Laboratório de Genômica e Expressão da UNICAMP, coordenado pelo Prof. Dr. Gonçalo Guimarães Pereira, que pela prévia experiência em outros projetos genoma foi nomeado coordenador geral; Centro de Pesquisas do Cacau (CEPEC) da CEPLAC, coordenado pelos Drs. Raul Valle e Karina Gramacho; a Universidade Estadual de Santa Cruz, coordenado pelos Drs. Júlio Cascardo e Dário Ahnert, e o Centro Nacional de Recursos Genéticos (CENARGEN) da EMBAPA, coordenado pelos Drs. Luís Antônio Barreto de Castro e Genaro Paiva. Esses grupos receberam como meta o seqüenciamento de 37500 fragmentos de DNA no intervalo de 24 meses (extensíveis até 36 meses), devendo portanto ser realizado pelo consórcio o seqüenciamento de 150.000 fragmentos de DNA, com o que espera-se gerar 75 Mb do genoma de C. perniciosa, sendo que desses pelo menos 37,5 Mb de alta qualidade (phred acima de 20). Recentemente conseguimos definir o tamanho do genoma desse fungo através de experimentos de pulse field. Foram identificados cerca de 7 cromossomos, sendo estimado um conteúdo de DNA por volta de 23 Mb. Isso significa que com a meta originalmente traçada deve-se conseguir uma cobertura de 2 a 3X o genoma, suficiente para a geração de um rascunho (draft) do mesmo.

Durante o processo de organização do projeto genoma de C. perniciosa foi desenvolvido na Unicamp um sistema de bioinformática que automatizou todo o processo de recepção e comparação de seqüências, criando ferramentas amigáveis para que os especialistas das mais diferentes áreas pudessem explorar os bancos de dados via interfaces simples como procura por palavra chave. As seqüências também foram listadas pelo nível de similaridade com seqüências previamente depositadas em bancos de dados, existindo hoje (junho/2001) cerca de 13.000 entradas. A análise desse material tem trazido importantes informações, como a descoberta de diversos genes relacionados a ciclo vegetativo (kinases, fosfatases, quitinase), ciclo sexual (genes codificando para ferormônios e receptores de ferormônios), proteção do fungo (hidrofobinas), penetração na planta (cutinase, lacase), genes de resistência da drogas (MDRs), elementos móveis (transposons e retrotransposons) e várias outras classes. Esse material já é mais do que suficiente para trabalhos de pós-genoma, fase que busca explorar os dados em busca de compreender o organismo e, em nosso caso, solucionar o problema da vassoura de bruxa.

7. Estratégias de combate à vassoura de bruxa

Em relação à pesquisa básica os seguintes temas estão sendo desenvolvidos para a compreensão de C. perniciosa: análise da mitocôndria, análise da expressão de genes em diferentes fases via chips de DNA, análise de proteínas de superfície, análise do ciclo sexual, mapeamento molecular dos cromossomos, análise de variabilidade genética entre cepas e biótipos e transformação genética do fungo.

Com relação à busca de soluções entendemos que existem algumas possibilidades. A primeira de natureza química, visando encontrar substâncias capazes de antagonizar o fungo, cuja produção possa ser feita por um valor razoável de forma a tornar a sua aplicação economicamente viável. Para isso estamos contando com o apoio do Instituto de Química da UNICAMP, o grupo da Profa. Anita Marsaioli, que está tentando o screening do fungo com vários extratos naturais. Também nesta direção iremos procurar compreender a estrutura de proteínas expostas pelo patógeno, como os receptores de hormônios ou as enzimas utilizadas para invadir a planta, que possam servir de alvo para moléculas antagonistas. É interessante observar que alguns receptores de hormônios já foram identificados em C. peniciosa e recentemente foi publicado uma estratégia para combate de um fitopatógeno através do disparo artificial da via de transdução iniciada com essa molécula (Beckerman et al., 1997).Uma segunda possibilidade seria via competição sexual. Foi observado no banco de dados uma série de genes relacionados à possível atividade sexual do fungo, como genes para a síntese e recepção de ferormônio. Ao mesmo tempo existe a possibilidade de que biotipos de C. perniciosa que não causam a doença possam invadir o cacaueiro e, ao menos teoricamente, cruzar com células de cepas patogênicas do fungo . Em vista disso uma atrativa estratégia de controle seria a geração de um fungo de um biótipo não patogênico transformado com um gene com promotor dicariótico específico controlando a parte codante de uma proteína nativa letal ao fungo se produzida em grande quantidade. Por exemplo, a quitinase ou algum fator regulatório. Esse fungo assim gerado poderia servir como controle biológico, sendo pulverizado nas culturas de cacau. Na presença de células de um biótipo patogênico, esse tenderia a cruzar com o fungo pulverizado (presente em alta densidade) e ao formar-se o dicarion o gene letal se expressaria e mataria essa célula. Assim as células do fungo patogênico não progrediriam. Uma terceira possibilidade seria a criação de plantas de cacau transgênicas, expressando nas regiões meristemáticas, que normalmente são atacadas pelo fungo, substâncias antagônicas a esse. Entretanto, essa estratégia, embora seja possível do ponto de vista tecnológico e tenha enorme potencial para revolucionar a produção de alimentos (Somerville and Briscoe, 2001), enfrenta atualmente problemas de natureza política para ser implementada. Há no momento uma grande resistência aos transgênicos por parte da sociedade, o que nos parece um movimento positivo no sentido de forçar os pesquisadores a identificar estratégias realmente seguras. O nosso projeto não prevê o trabalho com plantas transgênicas, mas admitimos que esse tipo de abordagem é extremamente poderosa e não pode ser desprezada. Cremos que no futuro próximo devam surgir grupos interessados em desenvolver o tema e esperamos que esses venham sempre a tomar todas as precauções possíveis em relação às normas de biossegurança, informando abertamente à sociedade os seus propósitos, a sua metodologia e os seus resultados.

8. Aspectos políticos e financeiros

A iniciativa para a realização do Projeto Genoma de C. perniciosa nasceu em fevereiro de 2000 em grande parte alimentada pelo sucesso do projeto genoma de Xylella fastidiosa, realizado por uma rede de pesquisadores no estado de São Paulo e financiado pela FAPESP/Fundecitrus. Dela resultou o seqüenciamento do primeiro fitopatógeno no mundo (Simpson et al., 2000), feito que foi amplamente divulgado nacional e internacionalmente. Através de um pequeno documento de 5 páginas enviado à Secretaria de Indústria e Comércio do Estado da Bahia (SICM), era colocado o fundamento de um projeto genoma e os benefícios que ele poderia trazer. O projeto teve o apoio da SICM e de pessoas como Antônio Magalhães, Ronaldo Abude e Carlos Macedo, esse último presidente da Biofábrica, que fizeram o pré-projeto circular entre os técnicos e cientistas da região produtora. Em maio desse mesmo ano a UESC recebeu o projeto e o Pró-Reitor de Pesquisa, Prof. Dr. Dário Ahnert, nos convidou para uma apresentação formal do mesmo junto à Universidade e à CEPLAC. Isso foi realizado e as duas Instituições decidiram por envidar esforços para a sua realização. Já em julho a Secretaria de Agricultura compreendeu a importância desse empreendimento e através de parecer do Dr. Hermínio Maia Rocha, Presidente do EBDA, decidiu firmemente que o apoiaria, inclusive integrando a EMBRAPA/CENARGEN ao mesmo. Esse movimento culminou com a assinatura do Protocolo de Intenções em 4 de setembro de 2000 na Governadoria do Estado (esse documento pode ser obtido na página do projeto no subítem programa). Por ele foi oficialmente criada a Rede de Genômica do Estado da Bahia, fazendo parte dela as Instituições UNICAMP, UESC, CEPLAC e EMBRAPA, com o compromisso por parte do Estado em disponibilizar a quantia de R$1.300.000,00 no intervalo de 24 a 36 meses para a realização do projeto. Os grupos participantes se comprometeram a realizar cada um, neste período, 37.500 reads, esses com pelo menos 250bp de alta qualidade (phred acima de 20) Esse ato firme por parte do Estado da Bahia atraiu grande atenção da mídia e dos órgãos federais para o projeto, para a região e para as instituições participantes. Por mérito dos seus cientistas, a UESC foi logo depois selecionada para integrar a Rede Brasileira de Genômica, através do Prof. Dr. Júlio Cascardo, o que proporcionou grande visibilidade à Instituição e a aquisição de equipamentos também utilizados em nosso projeto. Já em dezembro, o CNPq/MCT espontaneamente expressou a sua intenção de ampliar a nossa rede, o que foi efetivado em abril de 2001 pelo anúncio formal do Presidente da República. Com a disponibilização de R$ 800.000,00 será possível a expansão para mais 4 novos laboratórios da Bahia, 2 da Universidade Federal da Bahia: Faculdade de Farmácia:coordenado pela Dra. Marilda Gonçalves, e Instituto de Biologia, Coordenado pelo Dr. Geraldo Aquino; Universidade Estadual de Feira de Santana, coordenado pelo Dr. Aristóteles Góes Neto; e Universidade Católica do Salvador, Coordenado pela Dra. Luzimar Fernandes. Isso ampliará significativamente a nossa meta de seqüenciamento. Mais importante, essa ampliação munirá a Bahia de competência na estratégica área da genômica, preparando o Estado para investimentos privados da Indústria de Biotecnologia.

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